巨噬細胞移動抑製因子在病毒性心肌炎中的作用
电话直呼
在线客服
在线留言
发送邮件
企业地标
联系我们:
联系人:劉經理
电话:18202897410   | 028-85317716
銷售經理
點擊這裏給我發消息
溫馨提示:因考慮到客戶至上的經營理念,以節約您的等待時間為目的,人兽交欧美A片的工作人員,建議您點擊下麵‘發送郵件’/‘ QQ在線谘詢’ 功能進行采購谘詢!
還可輸入字符200(限製字符200)

公司新聞


巨噬細胞移動抑製因子在病毒性心肌炎中的作用

巨噬細胞移動抑製因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)由活化T細胞產生, 因其可以抑製離體巨噬細胞遷移和在皮膚遲發性超敏反應中促進巨噬細胞的聚集而得名。 MIF是一種重要的前炎症細胞因子,參與急性胰腺炎、潰瘍性結腸炎、腎炎等多種炎症性疾 病的發生和發展,然而 MIF在病毒性心肌炎(viral myocarditis)發病過程中的作用鮮有報 道。黃芪甲苷為一種黃芪有效成分 皂苷類的單體成分。本課題組前期研究表明,黃芪甲苷對 Balb/c小鼠柯薩奇病毒B。(CVB。)性心肌炎有明顯的治療作用 ,但其作用機理尚未完全 闡明。本研究通過觀察MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌組織中的表達,以及不同劑量黃芪甲苷 幹預後的改變,從而探討MIF在病毒性心肌炎發病機製中的作用及黃芪甲苷的幹預效果,為 臨床治療病毒性心肌炎提供理論基礎和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、試劑和儀器 黃芪甲苷(批號0781— 9706)由中國藥品生物製品檢定所提供, 為純白色幹 粉劑,不溶於水,用助溶劑羧甲基纖維素鈉製成均勻 懸液,濃度分別為1 、9 。 兔抗鼠的MIF多克隆 抗體購於Santa Cruz公司。Trizol試劑、Super— scriptⅡ逆轉錄試劑 盒及PCR試劑盒購於Invitro— gen公司。二氨基聯苯胺(DAB,武漢博士德公司)。 PIPS一 2020圖像分析儀(重慶天海公司);3K30型離 心機(美國Sigma公司)。
1.1.2 動物 雄性純種Balb/c小鼠(批號SCYK 滬2002—0002),4周齡,體重12~16 g, 由複旦大學 動物實驗科學部提供,飼養於SPF級環境中。
1.1.3 病毒 柯薩奇病毒B。(CVB。),Nancy株, 由複旦大學附屬中山醫院衛生部病毒 性心髒病重點 實驗室提供,在Hela細胞中傳代,凍融離心3次,分 裝上清液,並在Hela 細胞測5O 組織感染率 (TCID 。)為1×10 ,一70℃保存備用。實驗用量為 1× 10 TCID50。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構建和給藥方法 將55隻Balb/c 小鼠隨機分為4組:正常對照組(A組, ===10)、模型 對照組(B組,”一15)、低劑量幹預組(C組, 一15) 和高劑量幹預組(D組,” 一15)。A組小鼠僅腹腔接 種0.1 mI 病毒培養液,其餘3組每隻鼠經腹腔接 種0.1 mL 內含l×10 TCID 。CVB。的病毒液建立 病毒性心肌炎實驗模型。A、B組於接種當日開始 用 羧甲基纖維素鈉溶液0.1 mL灌胃,c、D組分別 以1 V0、9 黃芪甲苷0.1 mI 灌胃,均 為1次/d,連 續2周。觀察15 d,記錄各組每天存活小鼠數。第 15天無痛處死各組存活 小鼠,留取心髒,將心髒沿 左室中線切為兩半,一半用4 甲醛溶液固定,石蠟 包埋後, 作病理組織學和免疫組化檢測;另一半迅速 放入液氮,再轉移至一7O℃冰箱保存,用於提 取總 RNA 。
1.2.2 MIF蛋白質的免疫組化檢測 按常規ABC 法進行免疫組化檢測,DAB顯色,光鏡 下觀察結果, 細胞內呈顆粒狀或均質狀棕色反應為陽性。本實驗 用磷酸鹽緩衝液(PBS)代 替一抗作為空白對照。在 PIPS一2020圖象分析儀上,每個切片隨機取5個高倍視野,測 定一定麵積內陽性信號麵積和陽性信號 平均灰度值,計算陽性信號指數,作為MIF表達水 平。陽性信號指數一陽性信號麵積×陽性信號平均 灰度值/N定麵積×100
1.2.3 MIF mRNA 的RT—PCR檢測 采用Trizol 試劑抽提心肌組織總RNA,獲得的 RNA按Super— scriptⅡ逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。按PCR試 劑盒說明進行DNA擴 增,MIF引物序列:上遊5,_ ATGGCACGAATGAGGAAGAG一3 , 下遊: 5 GAAAAAGCCTCCCCTTCTTG一3 ,擴增產物長度 196 bp。GAPDH 引物序列:上遊: 5,_AG— GAGCGAGACCCCACTAACAT一3 ,下遊:5 rlGT— GATGGCATGGACTGTGGT 3 ,擴增產物長度 313 bp。PCR反應條件:95℃預變性3 rain, 然後 94℃ 30 S、55。C 1 rain、72℃ 1 rain,反應35個循 環後72℃延伸10 rain。取上述 PCR產物5 L,在 含1.5 溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳分離後,掃描儀 掃描,用Total lab 分析軟件進行條帶掃描分析,計 算MIF PCR產物吸光度與GAPDH 產物吸光度之 比值, 作為MIF tuRNA相對含量。
1.2.4 病理學檢查常規蘇木素一伊紅(HE)染色, 200倍光鏡下觀察心肌病理改變,並根 據Kishimoto 方法 計算心肌病變(炎性浸潤及壞死)積分。即每 張切片隨機取5個高倍視 野,計算每個視野中炎性 細胞浸潤及壞死區域麵積與整個視野的麵積之比。 無病變計0 分,病變麵積<25 計1分,25 ~50 計2分,50 ~75 計3分,>75 計4分。 1.3 統計學處理 用SPSS11.0軟件進行統計分 析,數據采用 ±S表示,組問比較采用單 因素方差 分析,百分率的比較采用Y 檢驗。

2 結 果

2.1 各組小鼠死亡率 接種後15 d,A組無小鼠 死亡,B、C、D 組死亡率分別為46.7 (7/15)、 40.0 (6/l5)、13.3 (z/15),D組死亡率較B、C 組明顯降低(P<0.05),但c組 與B組比較差異無 顯著性(P>0.05)。
2.2 心肌病理組織學變化 A組心肌排列規則,胞 漿著色均勻,無炎性細胞浸潤。B組可 見病變的心 肌細胞壞死崩解,胞核和細胞輪廓消失,周圍出現大 量的炎症細胞浸潤,間質 內可見較多的膠原纖維。 C組和D組上述病變減輕,尤以D組改善最為顯 著,僅見少量 的壞死灶和炎性細胞浸潤。D組心肌 病理積分明顯低於B、C兩組(P0.05),見圖1、表1
2.3 MIF mRNA表達瓊脂糖凝膠電泳結果進行 半定量分析顯示,B組心肌MIF mRNA表 達量明 顯高於A組(P<0.01),表明MIF在病毒性心肌炎 小鼠心肌表達顯著升高。黃芪甲苷 幹預後,D組明 顯降低.與B組和c組比較.差異有顯著性(P< 0.01),而B、C 兩組比較差 異無顯著性.見表1、 圖2。
2.4 MIF蛋白質表達 A組心肌細胞胞漿內可見 散在著色較淺的棕黃色陽性顆粒,而B組陽 性顆粒 數目顯著增多,著色更深,尤以病灶部位明顯(圖3)。C組和D組小鼠經黃芪甲苷幹 預治療後,陽性 顆粒數目減少,MIF免疫組化陽性信號指數的動態 變化與MIF mRNA表 達水平的變化相似,見表1。

3 討 論

MIF作為一種前炎症細胞因子,在炎症反應和 免疫調節中發揮重要作用。當機體受到微生 物感染 或發生應激反應時,T細胞、B細胞、垂體前葉細胞 及單核巨噬細胞等免疫細咆釋 放大量MIF。MIF 不僅有抑製巨噬細胞遊走、黏附、吞噬和聚集的功 能,還有促進巨噬細 胞在炎症局部浸潤、增生、激活, 以及通過調節細胞信號轉導,促進某些細胞因子的 表達, 分泌細胞因子,如1I 一18、II 6、IL一8、TNF a及 IFN 7等,同時使NO釋放增加和磷 脂酶A。的表達 增強,極大地促進炎症反應 。本研究發現,模型對 照組心肌MIF mRNA 和蛋白質表達水平顯著高於 正常對照組,提示MIF在病毒性心肌炎發生、發展 中起重要 作用。Matsui等 發現在實驗性自身免 疫性心肌炎中,心肌組織中MIF mRNA 和蛋白質 水平明顯增加,此外,血清MIF濃度也顯著升高。 而通過MIF中和抗體阻斷MIF的表達, 則可以明 顯減輕心肌的病變程度,並降低心肌中II 一l8和 TNF—a的表達。同樣,Shioji 等 一在研究自身免疫 性巨細胞性心肌炎時發現,當注射MIF中和抗體 後,心肌炎症病變 顯著減輕。上述研究表明,MIF 可能與病毒性心肌炎的形成有密切關係,有望成為 治療病 毒性心肌炎的一種關鍵靶分子。
黃芪對病毒性心肌炎有良好的治療作用,具有 抑製病毒複製,改善心功能,減輕心肌病理 改變等療 效 ]。黃芪甲苷為我國擁有自主知識產權的一種黃 芪皂苷類單體成分,為黃芪製 劑中的主要有效成分, 黃芪製劑的質量控製標準都是以黃芪皂苷的含量為 指標。本課題組 前期研究證實 ,黃芪甲苷可以明 顯提高感染CVB。小鼠的生存率,改善心肌組織病 理改 變,減輕炎症細胞浸潤及壞死病灶,降低心肌組 織中病毒滴度及病毒RNA 的複製水平, 對接種CVB。小鼠的病毒性心肌炎療效確切,而且毒性很 低,但對其作用機製不完全清楚。 本研究中,病毒性 心肌炎小鼠給予高劑量黃芪甲苷幹預治療後,MIF 表達顯著下調,心肌 損害減輕,小鼠死亡率降低,而 低劑量黃芪甲苷幹預則無此作用,提示黃芪甲苷能 降低病 毒性心肌炎小鼠的死亡率,減輕心肌損害,對 病毒性心肌炎有良好的治療作用,並且呈現 出劑量 依賴性,其機製可能與抑製MIF表達,減輕MIF介導的心肌炎症反應有關。總之, 病毒性心肌炎小鼠 急性期存在MIF表達上調,黃芪甲苷能顯著下調 MIF表達,減輕心肌炎 症反應,改善預後,這為黃芪的進一步開發應用打下基礎。