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酶轉化法提高黃芪甲苷的得率

黃芪是常用中藥之一,具有補氣、降壓、強心、消炎和增強抗病毒能力等功效。研究發現, 黃芪的主要有效成分黃芪皂苷中低糖基黃芪甲苷的藥效高,關於其報道也相繼出現,如毛羽 等在6 種菌株中找出了能夠更好水解黃芪總苷中含多糖基的黃芪皂苷的酶Absida.sp.39。 肖麗麗等用矽膠柱層析法對黃芪皂苷生物轉化產物進行分離純化,經檢測,轉化物為黃芪甲 苷。劉景利等利用AB-8大孔吸附樹脂和D-280離子交換樹脂富集黃芪甲苷,經薄層層析和 高效液相色譜檢測,證明了黃芪甲苷的相對含量明顯提高。劉超等確定了微生物所產的黃芪 皂苷酶將3個糖基黃芪皂苷轉化為黃芪甲苷的酶性質。這些報道多側重於黃芪皂苷酶性質的 研究及黃芪皂苷生物轉化物質的富集與純化。對於黃芪甲苷,它的苷元結構與黃芪總皂苷中 3個糖基皂苷是相同的,通過酶轉化就可以得到。黃芪總皂苷中3個糖基皂苷的含量可達 1O ~15 ,所以本實驗主要通過對黃芪總皂苷提取純化方法的研究,達到提高黃芪總皂苷 中3個糖基皂苷的含量,再經酶轉化,從而提高黃芪甲苷的得率。

1 材料和方法

1.1 材料與設備
黃芪,黃芪甲苷標準品,粗酶液;薄層層析板 Silica Gel 60F254,AB-8樹脂,HP-20樹脂。

1.2 方法

1.2.1 水提法提取黃芪總皂苷
精選黃芪根莖切片1 kg,提取過程分2次,第 1次用12倍黃芪質量的去離子水提取4 d; 第2 次加水量為黃芪質量的1O倍,提取3 d。水提液 用濾紙過濾濃縮後,加入3倍濃縮 液體積的95 乙醇,靜置24 h,過濾去除沉澱,濾液濃縮,回收乙醇。

1.2.2 醇提法提取黃芪總皂苷
精選黃芪根莖切片1 kg,提取過程分2次,每次提取4 d。第1次乙醇量為黃芪質量的1O 倍;
第2次乙醇量為黃芪質量的8倍。醇提液用濾紙過濾後減壓濃縮,回收乙醇。

1.2。3 薄層層析檢測
將薄層層析板在l1O℃ 烘箱活化3O~ 60 min,用刻度毛細管吸取標準品及樣品,點樣於 薄層層析板上。每次的點樣量依照樣品濃度確定,每次點樣後均須用電吹風吹幹。將點好樣 品的薄層板放入層析缸的展開劑中,浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5~1.0 cm(切 勿將樣點浸入展開劑中),密封蓋,待展開至規定距離後,取出,吹幹溶劑,用顯色劑顯色。 然後選擇最佳的提取 工藝進行黃芪總皂苷的純化。展開劑 (氯仿): (甲醇): (水)一8:3: 0.5,顯色劑為10 的 H2S0 水溶液。

1.2.4 A13-8大孔吸附樹脂純化黃芪總皂苷
將得到的黃芪總皂苷濃縮液用1/3體積的石 油醚萃取脫脂3次,每次萃取3 h,合並下層 溶液。將得到的脫脂濃縮液上AB-8樹脂柱(柱長 25 cm),反複上柱4"-5次,直至樣品被充 分吸附 為止。用5倍量的去離子水洗滌樹脂柱,再用2 倍量的80 乙醇洗脫,收集洗脫液, 旋轉蒸發,幹 燥得黃芪總皂苷粗品。

1.2.5 正丁醇萃取純化黃芪總皂苷
將得到的黃芪總皂苷濃縮液用1/3體積的石 油醚萃取脫脂3次,每次萃取3 h,合並下層 溶液, 再用1/3脫脂濃縮液體積的水飽和正丁醇重複萃 取3次,每次萃取2 h,合並正 丁醇層,旋轉蒸發,幹燥得黃芪總皂苷粗品。

1.2.6 酶反應製備黃芪甲苷
稱取以上兩種方法純化得到的黃芪總皂苷各5 g,配製成20 mg/mL 底物溶液(200 mL 0.02 mol/L pH 5.0的NaAc-HAc緩衝液加 95 9,6乙醇50 mL),與250 mL酶液(0.02 mol/L pH 5.O的NaAc—HAc緩衝液體係)等體積混合, 在RAT玻璃反應釜中30℃反 應24 h。

2 結果與討論

2.1 水提法與醇提法對黃芪總皂苷提取效果的影響
分別采用水提法與醇提法提取黃芪總皂苷, 薄層層析檢測譜圖見圖1。通過對圖1的分析 可知,在兩種提取方法中,醇提法的皂苷含量要高於水提法中的皂苷含量,而水提法的粗品 含量要明顯的高於醇提法,這主要是因為水提過程中,溶進了較多的親水性物質,但是醇提 法中這樣的物質就少一些,有利於黃芪總皂苷的進一步純化。因此采用醇提法來製備黃芪總 皂苷。

2.2 AB-8大孔吸附樹臘法與正丁醇萃取法對黃芪總皂苷純化效果的影響
經醇提法得到的2.5 L濃縮液上AB-8樹脂 柱,充分吸附後,進行洗脫,收集洗脫液,旋 轉蒸 發,幹燥得黃芪皂苷粗品11 g。薄層層析檢測譜 圖如圖2中1所示,經AB-8處理, 水洗糖使黃芪 總皂苷中含糖量減少,但在水洗糖的同時也洗掉 3個糖基皂苷,損失大,總 皂苷得率隻有1.1 。 用正丁醇萃取法處理醇提法得到的2.5 L濃縮液 後,蒸幹得到的 黃芪總皂苷粗品為40 g,得率為 4.O 。薄層層析檢測如圖2中2所示。正丁醇 不但可以 萃取濃縮液中大部分的3個糖基皂苷, 使黃芪總皂苷提取率得以提高,也可以有效除去 小 分子物質。但是,其總皂苷中含糖較高,精心用 HP-20大孔樹脂除糖,得到粗品的64 9,6 除糖總 皂苷。
從圖2中可以看到,醇提法製備的黃芪總皂 苷經AB-8大孔吸附樹脂純化後,3個糖基皂苷 的 量有明顯的減少,這可能是因為AB一8大孔吸附 樹脂對3個糖基皂苷的吸附力較低, 從而造成了 在水洗糖的過程中對其損失大。正丁醇萃取法可 以有效地萃取黃芪總皂苷中的 3個糖基皂苷,使更多的3個糖基皂苷通過酶轉化變成黃芪甲苷,從而提高黃芪甲苷的得率。

2.3 酶反應製備黃芪甲苷
酶反應24 h之後加入1 500 mL 95 的乙 醇,靜置4 h後在8 000 r/min下離心8 min,取 上 清液。上清液進行減壓濃縮、幹燥,得到的物質即 為黃芪皂苷酶解產物。AB-8大孔吸 附樹脂純化 得到的黃芪總皂苷經酶處理,薄層層析譜圖如圖 3中3所示,得到酶解產物3.8 g,產物得率為 76% ,其中黃芪甲苷的得率為4.0 左右。正丁 醇萃取純化得到的黃芪總 皂苷經酶處理,薄層層 析譜圖如圖3中4所示,得到酶解產物4.1 g,產 物得率為82 , 其中黃芪甲苷的得率為20 左 右,比反應前提高了l5 。
由圖3分析可知,AB-8大孔吸附樹脂純化得 到的黃芪總皂苷經酶轉化後,黃芪甲苷的得 率不高,這是因為在純化過程中對3個糖基皂苷的損失大,以及一些沒洗掉的小分子物質所 造成的。 而通過正丁醇萃取法純化得到的黃芪總皂苷經酶 轉化後,由於對3個糖基皂苷的 萃取效果好,使得可用於轉變成黃芪甲苷的3個糖基皂苷的含量升高,其轉化率又可以達到 90% ,所以黃芪甲苷的得率提高為20% ,比反應前提高了約15 。

3 結論

通過對水提法和醇提法提取黃芪總皂苷的比較研究,最終采用醇提法來提取黃芪總皂苷。 在進行純化過程中,比較了AB-8大孔吸附樹脂法和正丁醇萃取法,由薄層層析檢測譜圖可 以看出,正丁醇萃取法要明顯優於AB-8大孔吸附樹脂法,其原因是正丁醇能夠很好地從溶 液中萃取出 3個糖基皂苷,也可以有效地除去小分子物質。 純化後的黃芪總皂苷經酶轉化 生成黃芪甲苷,可提高黃芪甲苷的得率,從而提高黃芪總皂苷的藥用價值