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公司新聞


關於保健食品中黃芪甲苷含量測定的研究

準確測定保健食品中黃芪甲苷的含量對於含黃芪保健食品的質量監控是非常重要的,而保健 食品中的植物性成分嚴重幹擾黃芪甲苷的測定。目前研究的多是測定中成藥或中藥材中的黃 芪甲苷的方法,尚沒有建立成分複雜的保健食品中黃芪甲苷含量測定的高效分析方法。目前 的可見分光光度法、薄層掃描法、熒光分光光度法等難以實現複雜樣品的準確、靈敏、穩定 檢測;色.質聯機用因其昂貴價格在推廣應用中受到限製。高效液相色譜.紫外檢測器為測 定黃芪甲苷的常用方法,易普及,但因黃芪甲苷僅具有末端紫外吸收,加上溶劑背景難以消 除、保健食品中性質相近物質幹擾等影響,結果易受幹擾,且響應較低。故本研究擬摸索提 高保健食品中黃芪甲苷測定的紫外響應和消除雜質幹擾的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器高效液相色譜儀(Waters 600,二極管陣列檢測 器),液相色譜(Thermo Surveyer) 一質譜(LTQ)聯用儀,氮吹儀 (OA—SYS,Organomation Associates,Inc),紫外分光光度 計(島津, Biosespee一1601)。
1.1.2 試劑 黃芪甲苷標準品(中國藥品生物製品檢定所), 苯甲酰氯,氯仿,吡啶,D.101、 D.101一I、DM.301大孔吸附樹脂 淨品,Oasis HLB 3cc固相萃取柱。

1.2 方法

保健食品中多含有脂溶性和水溶性雜質,在文獻報道和前期實驗摸索基礎上,樣品經甲醇 超聲提取和乙醚脫脂、水飽和正丁醇萃取、堿洗三步液液萃取初步去除雜質。實驗主要對大 孔吸附樹脂柱層析、固相萃取、衍生化反應條件 和HPLC條件進行了篩選。
1.2.1 大孔吸附樹脂條件的研究 樣品初步處理後多呈粘稠、色深,檢測幹擾較大,分析 樣品中還含有一些性質和黃芪甲苷相近的物質未能去除,如黃酮、其他皂甙類物質。大孔吸 附樹脂常用於皂甙類物質的除雜,因此試驗選擇D.101、 D.101一I、DM.301大孔吸 附樹脂進行柱層析。971-tg/ml黃芪甲苷標準溶液過柱,選用多個濃度乙醇和水作為淋洗溶 劑,每種 條件下依次收集10ml,共收集5次,測定流出液體中黃芪甲苷 含量,篩選能最 大程度洗脫黃芪甲苷溶劑的濃度和體積,以及 不能洗脫黃芪甲苷的濃度和體積。通過加標 回收試驗考察 D.101、D.101.I、DM一301對除雜效果和黃芪甲苷回收率的影響,進 而選擇最佳型號大孔樹脂。
1.2.2 固相萃取條件的研究 大孔樹脂分離出的一般為總皂苷類物質 ,為將黃芪甲苷和 其他皂甙類物質分離、富集, 選擇Oasis HLB 3cc型固相萃取小柱進行固相萃取。試驗以 97ktg/ml黃芪甲苷標準溶液對水和多個濃度的甲醇、乙醇、乙腈淋洗和洗脫溶液進行篩選。
1.2.3 衍生化反應條件的研究 試驗發現經上述前處理後 色譜峰仍有幹擾,分析是黃芪 甲苷在近紫外區僅200rim末端 有吸收,很多其他物質在此波長範圍內均有吸收。故考慮在 其分子上連接發光基團,使紫外吸收波長紅移,以此消除幹擾。
1.2.3.1 衍生化反應條件的篩選 試驗選擇苯甲酰氯和三氯甲烷在毗啶溶液中將黃芪甲 苷衍生為苯甲酰黃芪甲苷,對反應時間、反應溫度、吡啶用量、苯甲酰氯用量四個反應條 件 按LI6—4—5正交設計進行測定,對黃芪甲苷標準溶液進 行衍生化,將測得的衍生化產物 量和未衍生黃芪甲苷量進行比較,計算回收率,篩選最佳反應條件。
1.2.3.2 衍生化產物的檢測波長的測定 將濃度為160ttg/ml的黃芪甲苷標準品衍生物 顯色體係,以試劑為空白,進行波長掃描,確定衍生化產物的檢測波長。
1.2.3.3 衍生化產物的質譜驗證和穩定性測試黃芪甲苷衍生化產物用液相一電噴霧質譜 法進行衍生化產物檢測,並測定了衍生化產物在4℃下保存1小時、5小時、l周、1個月、2 個月、4個月時的量,以考察穩定性。
1.2.4 高效液相色譜條件的選擇 試驗對Kromasil C (250mm×4.6ram,5/xm)、Nova.Pak C8(150mm x 3.9mm,5 )、 AccQ Tag TM C (150mm×3.9ram,5/xm)3種色譜柱和90% 甲醇 . 4% 四氫呋喃.6% 水、90% 甲醇一4% 四氫呋喃.6% 水.0.4%三 乙胺、 90% 甲醇.10%水、100% 乙腈4種流動相進行了篩選;流 速:1ml/min;柱溫:25℃ ; 檢測波長:230nm。

2 結果

2.1 大孔吸附樹脂柱層析條件的確定

結果顯示,D.101、D.101一I、DM一301不能洗脫下黃芪甲苷的乙醇最高濃度分別為 20% 、30%、30% ,完全洗脫下黃芪甲 苷的乙醇最低濃度(所需體積)分別為90% (30m1)、 70% (20m1)、80%(20m1)。
三種型號大孔吸附樹脂中,D一101和D一101.I的回收率均 低於DM一301,分析是D一 101和D一101一I屬於非極性樹脂,對樣 品中的非極性雜質吸附性較強,雜質搶先占據了 大孔樹脂上 的吸附位點,導致部分黃芪甲苷不能吸附在大孔樹脂上而隨 著淋洗溶液流失 了。而DM.301屬於中極性樹脂,和黃芪甲苷 的極性更為相近,對黃芪甲苷的吸附性較強, 不會出現黃芪甲 苷預先流失的現象。故試驗選擇DM一301大孔吸附樹脂。

2.2 固相萃取條件的確定

基於黃芪甲苷的極性特點以及Oasis HLB固相萃取柱同時具有親水性單體N一乙烯基吡咯 烷酮和親脂性單體二乙烯 基苯,黃芪甲苷可和親水性單體形成範德華作用力,能夠充分 吸 附。親脂性單體則與黃芪甲苷分子中的非極性基團作用, 產生反相保留。以上兩種作用使 得黃芪甲苷可以保留在 Oasis HLB固相萃取小柱中,當極性強的溶劑通過時可以將極 性比 黃芪甲苷強的物質洗脫下來,選用極性合適的溶劑將黃 芪甲苷洗脫下來時,極性比它弱的 物質則繼續保留在固相萃取柱上。結果顯示80%乙醇溶液洗脫時,黃芪甲苷回收率最 高, 且40%乙醇為不能洗脫下黃芪甲苷的乙醇最高濃度。故 從黃芪甲苷的回收率和安全角度考 慮,選擇40%乙醇為淋洗液,80%乙醇為洗脫液。

2.3 衍生化反應條件的確定

試驗選擇苯甲酰氯和三氯甲烷作為衍生化試劑,是基於在吡啶溶液中苯甲酰氯可將黃芪甲 苷中的羥基衍生為苯甲酰 基,最終生成苯甲酰黃芪甲苷,使其最大紫外吸收波長發生紅 移, 避免低紫外波長區雜質的幹擾。根據試驗結果結合正交 設計分析方法,確定反應時間12h, 反應溫度4℃ ,吡啶用量 lml,苯甲酰氯用量0.4ml為最佳衍生化反應條件。
波長掃描結果顯示衍生化顯色體係在 =230nm處有最大吸收,幹擾較小。因此確定230nm 波長為檢測波長(圖1)
衍生化產物的質譜驗證結果顯示,在標準和樣品的一級 全掃質譜圖上,均有豐度較高的 1744分子離子峰,二者1744 分子離子峰的二級全掃質譜圖中幾個豐度較高的分子離子峰 豐度比基本相同,判斷二者174 分子離子峰表示同一種物質,分析是黃芪甲苷分子結構中 有10個羥基被苯甲酰化後又 加上了一個鈉離子,證明該法較好的消除了雜質幹擾,以衍生 物色譜峰麵積對黃芪甲苷進行定量,準確度高(圖2~5)。
衍生物穩定性試驗結果顯示,在1小時、5小時、1周、1個 月、2個月、4個月測得的衍 生物量的RSD值為1.10% ,表明 衍生物在4~C下可穩定保存4個月。

2.4 高效液相色譜條件的選擇

2.4.1 色譜柱的選擇 結果顯示Kromasil C 保留時間在 70min左右,Nova—Pak C, 保 留時間在13min左右,二者峰形均 較滿意。AeeQ TagTMC。 色譜峰存在一定幹擾。因此 選擇保 留時間較短、峰形較好的Novapak C色譜柱。
2.4.2 流動相的選擇 結果顯示,90% 甲醇 10%水未出峰, 100%乙腈時峰受幹擾嚴重,90% 甲醇.4% 四氫呋喃.6% 水與 90%甲醇.4% 四氫呋喃.6%水一0.4%三乙胺保 留時間和峰形 均良好,因此選擇配製簡單的流動相90% 甲醇一4% 四氫呋喃. 6% 水。

2.5 樣品前處理流程和標準曲線的繪製

稱取適量樣品,甲醇超聲提取,提取液離心取上清,水浴 蒸幹後用蒸餾水溶解殘渣,轉入 分液漏鬥,用無水乙醚脫脂,每次60rnl,共3次,棄醚層。水層用4JDⅡll水飽和正丁醇 提取, 共3次,棄水層。合並正丁醇層,將正丁醇層用40ITll 1% KOH 洗3次,棄堿液 層。將正丁醇在沸水浴上蒸幹,用5nd蒸餾水 溶解殘渣。移入處理過的DM一301大孔樹 脂柱,用水和30% 乙醇淋洗,80% 乙醇洗脫,收集洗脫液,蒸幹後用4|D% 乙醇溶 解, 移人預處理過的固相萃取柱,40% 乙醇淋洗,80% 乙醇洗 脫,洗脫液蒸幹後用lml吡啶 溶解。向吡啶溶液中加入2ml 三氯甲烷和0.4rid苯甲酰氯,充分振搖lmin,4℃ 衍生12h, 氮 氣吹幹,甲醇定容。在給定儀器條件下標準溶液和樣品上機 檢測。具體儀器條件為:色 譜條件:Novapak C 色譜柱,流動 相90% 甲醇一4% 四氫呋喃一6% 水,流速lm]/ min,柱溫25℃ ,波 長230nm,進樣量2O。
精確量取0.10、0.20、0.50、1.0、2.0和4.0ml標準儲備液 至10.0ml容量瓶中, 用甲醇定容到10.0 ml,水浴蒸幹後,用 1.Oml吡啶溶解後加入2.0ml三氯甲烷和0.4rrd 苯甲酰氯在 4 下衍生12h,衍生液氮氣吹幹後用甲醇定容到10.Oml。進 行液相色譜測定。 結果線性方程為:;= 一236278.71+ 76061.56X .r=0.9996。

2.6 加標回收率、精密度試驗和檢測限的測定

樣品測定結果顯示,加標回收率為74.85% ~91.83% ;精 密度腳值為7.46% ;檢 測限為2.13 g/ml,表明試驗方法能 較好滿足樣品測定要求。

2.7 樣品的測定

按照以上建立的檢測方法對多種含黃芪市售樣品進行檢 測,結果顯示峰形良好,幹擾較少。 兩樣品色譜圖見圖6、圖 7

3 討論

現在很多保健食品以黃芪為其主要功效成分,尚無統一有效的測定保健食品中的黃芪甲苷 的方法,本研究建立了準 確、靈敏、穩定的成份複雜保健食品中黃芪甲苷測定方法,對黃 芪及其製劑的質量評價和合理開發利用提供了良好的實驗基礎。
本試驗將HLB Oasis 3cc固相萃取小柱應用到富集和淨化黃芪甲苷的前處理步驟中,結果證 明,此固相萃取小柱淨化效 果良好,對保健食品中黃芪甲苷的除雜和富集必不可少。本 試 驗首次將DM一301大孔吸附樹脂應用到黃芪甲苷的前處理除雜步驟中,按照極性由大到小 的順序進行淋洗,依次除去樣 品中的各種極性雜質。大孔樹脂化學性質穩定,不溶於酸、 堿 及有機溶劑,對有機物有濃縮分離作用且不受無機鹽類及強 離子、低分子化合物的幹擾, 操作簡便,因此大孔樹脂在保健 食品的除雜過程中是一種較理想的手段。
黃芪甲苷在近紫外區僅僅200nm末端有吸收,且靈敏度 很低,黃芪含有的多種成分對結果 幹擾很大。本試驗采用柱 前衍生化-高效液相色譜法,對黃芪甲苷分子中的羥基進行苯 甲 酰化反應,使最大吸收波長紅移至230nm處,提高了分離選擇性和檢測靈敏度,大大減少 了雜質的幹擾。最低檢出限、加標回收率、精密度均較好。因此,本試驗建立了成分複雜保 健 食品中黃芪甲苷的柱前衍生化.高效液相色譜測定法,為製定保健食品黃芪甲苷標準測 定方法提供了較好的方法基礎。